啊...我在WB上有很多其他乐队，该怎么办？
建议：1。
5％脱脂奶粉/ TBST，CST建议在室温下封闭1小时。
2）
由于一抗的稀释度大于参考抗体的稀释度，因此建议在4°C下孵育过夜。
3）
用5％脱脂奶粉/ TBST稀释二抗。工作浓度不太高，在室温下孵育1小时。
4）
用1XTBST缓冲液彻底清洗。
有两种情况用于具体分析。
实验条件：检测目标Phospho-Akt（Ser473）；使用抗体：CST＃4060 SPhospho-Akt（Ser473）（D9E）mAb XPRabbit；细胞系：MCF7。
问题：显示非特定的波段。
Phospho-Akt（Ser473）（绿色）检测到两个谱带。一个具有约60 kd的预期分子量，另一个具有稍大的分子量，并且两个谱带强度相同。
红色荧光是微管蛋白，一种内部参考蛋白。
解决方案：鼓励客户以较少的传代次数重新填充细胞。重新刺激和裂解后，获得单个条带。
问题分析：AKT激酶由三种分子量非常相似的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶组成：AKT1，AKT2和AKT3。
在正常条件下，Phospho-Akt（Ser473）仅需要一个条带，但是在某些条件下，AKT会进行糖基化，泛素化和其他修饰以改变蛋白质大小。会导致它。
在这种交流情况下，客户发现使用的细胞系超过25代，因此同一抗体再次用于较少数量的健康细胞，最终形成一条单带。是的
许多家庭实验室细胞传代不能准确记录传代数，因此即使这些细胞系的蛋白质表达谱发生变化，许多教师也可能会看到这些细胞系。还不清楚其他不知道自己细胞的细胞的影响，例如支原体污染。
因此，建议教师注意细胞系培养，定期检查细胞污染，控制传代次数，并仅使用健康细胞以确保可靠的实验。
我们建议您阅读以下内容，以了解支原体污染蛋白条带的影响。
你不知道WB能生长细胞吗？
一开始我迷路了！
这个有趣的案例来自2017年北京大学医学院生命科学中心研究组尹玉欣教授在《自然通讯》上发表的一篇文章。
作者首先使用全长PTEN抗体检测比PTEN稍小的条带，并且条带表达模式与PTEN相似（图2）。
a）
如果作者认为该条带是对抗体的非特异性识别，并且不会进行下一个详细研究，则没有如此大的文章。
当时，作者使用了CST＃9559PTEN（138G6）RabbitmAb抗体，该抗体在精神刺激下只能识别PTENC末端域（图2）。
b）识别N末端PTEN抗体（图2）。
c）在不同癌细胞系中的检测，质谱的进一步分析和验证。确认看到的第一个条带是PTEN样的N端PTofisoform。蛋白质家族及其功能多样性得到了更深入的了解。
5％脱脂奶粉/ TBST，CST建议在室温下封闭1小时。
2）
由于一抗的稀释度大于参考抗体的稀释度，因此建议在4°C下孵育过夜。
3）
用5％脱脂奶粉/ TBST稀释二抗。工作浓度不太高，在室温下孵育1小时。
4）
用1XTBST缓冲液彻底清洗。
有两种情况用于具体分析。
实验条件：检测目标Phospho-Akt（Ser473）；使用抗体：CST＃4060 SPhospho-Akt（Ser473）（D9E）mAb XPRabbit；细胞系：MCF7。
问题：显示非特定的波段。
Phospho-Akt（Ser473）（绿色）检测到两个谱带。一个具有约60 kd的预期分子量，另一个具有稍大的分子量，并且两个谱带强度相同。
红色荧光是微管蛋白，一种内部参考蛋白。
解决方案：鼓励客户以较少的传代次数重新填充细胞。重新刺激和裂解后，获得单个条带。
问题分析：AKT激酶由三种分子量非常相似的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶组成：AKT1，AKT2和AKT3。
在正常条件下，Phospho-Akt（Ser473）仅需要一个条带，但是在某些条件下，AKT会进行糖基化，泛素化和其他修饰以改变蛋白质大小。会导致它。
在这种交流情况下，客户发现使用的细胞系超过25代，因此同一抗体再次用于较少数量的健康细胞，最终形成一条单带。是的
许多家庭实验室细胞传代不能准确记录传代数，因此即使这些细胞系的蛋白质表达谱发生变化，许多教师也可能会看到这些细胞系。还不清楚其他不知道自己细胞的细胞的影响，例如支原体污染。
因此，建议教师注意细胞系培养，定期检查细胞污染，控制传代次数，并仅使用健康细胞以确保可靠的实验。
我们建议您阅读以下内容，以了解支原体污染蛋白条带的影响。
你不知道WB能生长细胞吗？
一开始我迷路了！
这个有趣的案例来自2017年北京大学医学院生命科学中心研究组尹玉欣教授在《自然通讯》上发表的一篇文章。
作者首先使用全长PTEN抗体检测比PTEN稍小的条带，并且条带表达模式与PTEN相似（图2）。
a）
如果作者认为该条带是对抗体的非特异性识别，并且不会进行下一个详细研究，则没有如此大的文章。
当时，作者使用了CST＃9559PTEN（138G6）RabbitmAb抗体，该抗体在精神刺激下只能识别PTENC末端域（图2）。
b）识别N末端PTEN抗体（图2）。
c）在不同癌细胞系中的检测，质谱的进一步分析和验证。确认看到的第一个条带是PTEN样的N端PTofisoform。蛋白质家族及其功能多样性得到了更深入的了解。